gmp級pei操作方法

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)

訂購信息

儲存溫度：2-4℃保存?年。（避免冷凍）

產品描述

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉染試劑，本制品利BIOHUB公司生產的線性陽離子聚合物,按照符合GMP認證管理體系下，采用藥用規(guī)格原輔料生產，所用起始材料及所需化學品和配制過程均在無菌環(huán)境中操作進行，以確保制造過程中每個步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴格控制重金屬殘留、細菌內毒素殘留等，生產工藝符合 GMP 規(guī)范的產品生產與質量管理規(guī)程，保障生產過程及所有原輔料可追溯。

操作方法參考

一、貼壁細胞轉染 以 6 孔板轉染 293T 細胞為例：

（一）轉染前準備

1) 轉染前一天：用膠原酶 （WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮DMEM:F12+5%FBS *培養(yǎng)基和 1ml 的細胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養(yǎng)箱培24h。

2) 24h 后,移除之前培養(yǎng)基，每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。

注意：確保 293T 細胞生長狀態(tài)良好傳代 不超過15代。

（二）轉染過程

3) 第一天：顯微鏡下檢查細胞匯合度，當細胞達到 70%到 80%的匯合度時，開始準備轉染。

4) 對于每孔細胞，用 100µl 無血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。

5) 對于每孔細胞，用100μ無血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP  的比例要依據自己實驗摸索最適比例。

6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中（總體積 200µL）輕輕混勻， 室溫孵育30分鐘。

7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP復合物滴加到細胞培養(yǎng)板每個孔中，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。

8) 將培養(yǎng)板放入 37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。

（三）觀察轉染結果 9) 第二天：在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，通常超過 80%的 293T 細胞在轉染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉染時應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進行優(yōu)化，以達到最適比例， 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI，用BIOHUB-PRO  GMP時應適當 降低使用濃度。

通常情況下，分別準備BIOHUB-PRO GMP 和DNA轉染溶液時其體積一般是轉染前每孔細胞培 養(yǎng)液體積總量的 1/10-1/20，如細胞培養(yǎng)液體積為 3ml，則稀釋BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的體積為150ul。質粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質量/細胞培養(yǎng)總體積）[1][4]。 不同質粒種類以及大小會影響轉染效率，如較大片段插入質粒可能轉染效率低，可根據 實際實驗需要調整，如適當增加轉染質?？偭康取??HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打，但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞，如果表達的是膜蛋白，胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達， 建議用膠原酶消化細胞，我們推薦(LS004196WORTHINGTONG)的膠原酶。 對于貼壁性低的細胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養(yǎng)基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例，就可以在轉染后 24 至 96 小時內多次觀察轉染效率，以優(yōu)化最大表達量時間點。

二、懸浮細胞轉染 離心對數(shù)期生長的細胞用新鮮的培養(yǎng)基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規(guī)模轉 染時，如需大規(guī)模轉染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL，可參考文獻[4]。以 293F 細胞 于 100mL 培養(yǎng)瓶（溶液體積占瓶體積的 1/5）操作體系舉例如下：

（一）轉染前準備

 1) HEK293F 細胞傳代接種于 20mL 懸浮細胞生長培養(yǎng)基中(36.5℃，120rpm，5%CO2 )的條 件下培養(yǎng)。當細胞密度到 1X10 6cells/mL，然后旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，2~4 小時 后可以進行轉染。

（二）轉染過程

 2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適量的 DNA，使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總 培養(yǎng)體積）?；靹虿㈧o置 5min。

 3) 用1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yǎng)基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻并靜置 10min。

（78BioPEI：DNA 參考比例范圍，可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO GMP和 DNA 優(yōu)化方案優(yōu)化）。

 4) 將BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中輕輕混勻，室溫孵育 30 分鐘。

 5) 將BIOHUB-PRO GMP轉染復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回搖床 （36.5℃，5%CO2,120rpm）。

 6) 基因表達可在 24-72 小時后檢測，具體時間取決于細胞系和轉基因.

小貼士

在懸浮培養(yǎng)中，單個細胞的轉染效率要高于聚集在一起的細胞，需要優(yōu)化適合單細胞的 生長條件。 方形瓶應經過兩個連續(xù)的干燥循環(huán)高壓滅菌（每個 45 分鐘，干燥 15 分鐘） 蓋子應盡可能松，不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前，將其*放入層流罩中。如果瓶子向內塌陷，細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產量，有參考文獻表明轉染后 24 小時，可以適當稀釋細胞，稀釋比例參考范圍（1:2—1:5）之間，可以增加蛋白產量，稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據經驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 轉染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉染，但必須經過上述 特定流程的 DNA 和轉染試劑的比例和用量的相應優(yōu)化。