SphereOTM技術(shù)說明STN-21

SPHEROTM Technical Note STN-21 Rev A 050520

SPHEROTM STREPTAVIDIN PARTICLES USES AND PROTOCOLS

SPHEROTM鏈霉親和素顆粒的用途和協(xié)議

鏈霉親和素
鏈霉親和素是一種蛋白質(zhì)（分子量約66000），由四個(gè)相同的亞單位組成，每個(gè)亞單位都含有生物素的高親和力結(jié)合位點(diǎn)（KD=10-15）
M） 。它與抗生物素蛋白具有相同的生物素結(jié)合特性，但觀察到的非特異性結(jié)合較少。它已被用于免疫分析和基因組分析
用于目標(biāo)檢測(cè)的分析。
道德原則
Spherotech鏈霉親和素珠表面設(shè)計(jì)為簡(jiǎn)單有效方法的基質(zhì)，例如：
•用于分離生物素化化合物（如蛋白質(zhì)、免疫球蛋白、糖、凝集素或DNA/RNA和microRNA）的蛋白質(zhì)包覆珠
•磁性鏈霉親和素包衣珠可用作免疫分析和基因組分析的基質(zhì)
•熒光標(biāo)記的鏈霉親和素小顆粒可用作檢測(cè)探針。

使用說明
Spherotech鏈霉親和素顆粒的制備
使用前應(yīng)清洗顆粒，以去除0.02%的NaN3
作為防腐劑添加的。通過使用
較大顆粒的離心。
1.輕輕搖動(dòng)小瓶，以獲得均勻的懸浮液。
2.向管中添加適量的顆粒（見下文“結(jié)合能力"一節(jié)）。
3.將試管置于1.5K的離心機(jī)中20分鐘。
4.用移液管抽吸上清液。避免用移液管端接觸顆粒顆粒。
5.添加推薦的緩沖區(qū)。使用與上述步驟2中相同的體積，然后輕輕地重新使用（不要使珠子產(chǎn)生漩渦）。
6.重復(fù)步驟3至5，最后一次清洗后，添加適當(dāng)體積的推薦緩沖液，以獲得適當(dāng)?shù)墓ぷ鳒囟?br/>顆粒濃度。

用于RNA操作的Spherotech鏈霉親和素顆粒的制備。
注：Spherotech鏈霉親和素不以無核糖核酸酶溶液提供。
1.向溶液a和溶液B中添加DEPC至0.1%（1ml/L）的最終濃度（見下文緩沖液和溶液部分）。
2.用力搖晃。
3.在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，并對(duì)溶液進(jìn)行高壓滅菌。
4.用相同體積的溶液A沖洗顆粒兩次，持續(xù)1-3分鐘。
5.用相同體積的溶液B清洗顆粒一次。
6.將顆粒重新懸浮在溶液B中。
生物素化程序
生物素化核酸、蛋白質(zhì)和肽很容易與Spherotech鏈霉親和素磁性顆粒結(jié)合，用于分離實(shí)驗(yàn)。遵循
在結(jié)合過程中，由于Spherotech磁粉的*磁性，生物素化產(chǎn)物易于操作。這個(gè)
當(dāng)粒子置于磁場(chǎng)中時(shí)，其磁性能簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程中的操作，如更換緩沖液。
生物素/鏈霉親和素連接系統(tǒng)（KD=10-15 M）的結(jié)合導(dǎo)致隔離的*非共價(jià)相互作用。
筆記：
•所有生物素試劑應(yīng)包含一個(gè)間隔臂，長(zhǎng)度至少為6個(gè)C原子，以減少空間位阻。
•樣品中的游離生物素會(huì)降低Spherotech鏈霉親和素顆粒的結(jié)合能力。一種可一次性使用的裝有液體的柱
Sephadex®將從樣品中去除未結(jié)合的生物素。
•生物素化寡核苷酸應(yīng)通過反相高效液相色譜法純化，以獲得最佳結(jié)合效率。
•建議在寡核苷酸引物的5′端進(jìn)行特異性生物素化，以保持3′端游離延伸。

寡核苷酸引物的生物素化。
a） 生物素化寡核苷酸可從寡核苷酸合成公司購買。
b） 合成反應(yīng)中的生物素磷酰胺允許生物素在5'-端發(fā)生，對(duì)標(biāo)記的寡核苷酸的特異性或熔化溫度沒有影響。
c） 通過化學(xué)摻入5'-或3'-氨基修飾的寡核苷酸進(jìn)行生物素化，將導(dǎo)致生物素酯的所有伯胺基團(tuán)
寡核苷酸。建議在DNA合成過程中直接將低聚物的5'端或3'端加入生物素。
2.生物素化引物的純化。
a） 生物素化寡核苷酸最好通過反相HPLC從未結(jié)合的生物素中純化，這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)橛坞x生物素
將占據(jù)珠子上的結(jié)合位點(diǎn)，并降低生物素化PCR產(chǎn)物的結(jié)合能力。這一凈化步驟也確保了全長(zhǎng)
標(biāo)記水平接近100%的脫氧核苷酸。
b） 生物素化寡核苷酸的HPLC純化是將全長(zhǎng)生物素化寡核苷酸裝載到鏈霉親和素包衣珠上所必需的。
NAP柱純化的寡核苷酸影響裝載過程。
3.已合成寡核苷酸的生物素化。
Photobiotin®標(biāo)記系統(tǒng)可將生物素引入已合成的低聚物中。生物素隨機(jī)并入寡核苷酸中。
4.較大DNA的片段的生物素化。
a） 建議在使用生物素磷酰胺進(jìn)行DNA合成期間，在低聚物的5'端直接加入生物素。a）使用帶有生物素化引物的PCR進(jìn)行末端標(biāo)記。
b） 酶法結(jié)合生物素dUTP標(biāo)簽。生物素dUTP標(biāo)簽可通過使用Klenow DNA聚合酶、缺口翻譯或混合引物標(biāo)記的末端標(biāo)記，以酶法并入雙鏈DNA的片段。
c） 光生物素化。生物素的光活化形式可以在紫外光下隨機(jī)并入DNA的片段。
5.使用可切割試劑進(jìn)行生物素化。
a） 生物素dUTP類似物與可切割連接物的酶結(jié)合。生物素與含有二硫化物的連接臂的結(jié)合
該鍵允許DNA的片段的簡(jiǎn)單解離，因?yàn)槎蜴I很容易被二硫蘇糖醇（DTT）切割。這種試劑
通過末端標(biāo)記、缺口翻譯或混合引物標(biāo)記將酶結(jié)合到DNA的片段中。建議使用生物素-21 SS dUTP。
b） NHS生物素鳥苷類似物的化學(xué)摻入。亞氨基生物素的摻入允許結(jié)合核酸的解離
pH值發(fā)生簡(jiǎn)單變化的酸片段。鏈霉親和素/亞胺生物素復(fù)合物在pH 4.0下解離。在pH值為9.5或更高時(shí)，亞胺生物素將與Spherotech鏈霉親和素顆粒緊密結(jié)合。釋放的亞胺生物素可重新固定在Spherotech鏈霉親和素顆粒上。