dld-diagnostika 組胺 ELISA使用說明書

組胺 ELISA

酶免疫分析

用于定量測(cè)定血漿、尿液和細(xì)胞培養(yǎng)基中的組胺

his-e_6

dld-diagnostika 組胺 ELISA目錄

1. 試驗(yàn)介紹和原理

組胺（β-咪唑-乙胺）是一種生物胺，是組氨酸代謝的產(chǎn)物。由組氨酸脫羧產(chǎn)生。

組胺廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中。它與肝素（非活性形式）結(jié)合并儲(chǔ)存在嗜堿性白細(xì)胞和肥大細(xì)胞的顆粒中，并根據(jù)需要主動(dòng)釋放。這些細(xì)胞如果被附著在其膜上的 IgE 抗體致敏，當(dāng)暴露于適當(dāng)?shù)目乖瓡r(shí)發(fā)生脫顆粒。

組胺在過敏反應(yīng)的初始階段起主要作用。

變應(yīng)原給藥后血漿中組胺的定量具有臨床意義。

組胺是對(duì)外來病原體免疫反應(yīng)的一部分，它增加毛細(xì)血管對(duì)白細(xì)胞和  其他蛋白質(zhì)，以便允許它們?cè)谑苡绊懙慕M織中與外來入侵者接觸。負(fù)責(zé)組織中組胺生物學(xué)效應(yīng)的是不同表面受體的激活，例如 H1、H2 和 H3。

組胺參與調(diào)節(jié)腸道生理功能，并作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。

競(jìng)爭(zhēng)性組胺 ELISA 試劑盒使用微量滴定板形式。組胺與微量滴定板的固相結(jié)合。酰化組胺和固相結(jié)合組胺競(jìng)爭(zhēng)固定數(shù)量的抗血清結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)時(shí)，通過洗滌除去游離抗原和游離抗原-抗血清復(fù)合物。通過抗兔/過氧化物酶檢測(cè)與固相組胺結(jié)合的抗體。在 450 nm 處監(jiān)測(cè)底物 TMB/過氧化物酶反應(yīng)。與固相組胺結(jié)合的抗體量與樣本中的組胺濃度成反比。

2. 注意事項(xiàng)

· 僅供體外診斷使用。

· 應(yīng)使用一次性手套和護(hù)目鏡。

• 對(duì)本試劑盒中使用的所有人源試劑進(jìn)行了 HIV I/II 抗體、HCV 和 HBsAg 檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。但是，由于沒有任何試驗(yàn)方法可以*保證不存在傳染性病原體，因此這些試劑應(yīng)作為具有潛在生物危害性的材料進(jìn)行處理。
• 試劑盒制備中使用的動(dòng)物源性材料來自經(jīng)認(rèn)證的健康動(dòng)物，但這些材料應(yīng)視為具有潛在傳染性進(jìn)行處理。

· 該試劑盒的某些組分含有有害試劑。這些組件標(biāo)有適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)標(biāo)簽。

3. 儲(chǔ)存和穩(wěn)定性

到貨后，在 2-8 °C 條件下儲(chǔ)存試劑盒。一旦開封，試劑盒在失效日期前可保持穩(wěn)定。有關(guān)制備試劑的穩(wěn)定性，請(qǐng)參閱試劑制備。請(qǐng)勿使用超過試劑盒標(biāo)簽所示失效日期的組分。請(qǐng)勿在單次測(cè)定中混合任何試劑盒組分的不同批次。

4.3 對(duì)照 1 和 2

每 4 mL，即用型范圍：見 q.c. 證書

2 瓶

4.4 酰化緩沖液

6 mL，顏色代碼為藍(lán)色，即用型

4.5 ?；噭?/span>凍干，將內(nèi)容物溶于 1.5 mL 溶劑

1 瓶

3 瓶

4.6 溶劑

5.5 mL 溶劑溶解酰化試劑含丙酮，即用型

    警告              危險(xiǎn)

4.7 抗血清

5.5 mL，即用型，顏色編碼為黃色兔抗 N-?；?組胺

1 瓶

1 瓶

4.8 酶結(jié)合物

12 mL，即用型

羊抗兔 IgG 過氧化物酶

       警告

1 瓶

4.9 清洗緩沖液

20 mL，50 倍濃縮

用蒸餾水將內(nèi)容物稀釋至 1 l 總體積

4.10 底物

12 mL TMB 溶液，即用型

4.11 終止液

12 mL，即用型

含 0.3 M 硫酸

4.12 反應(yīng)板

用于?；?/span>

4.13 平衡試劑

凍干，用蒸餾水溶解內(nèi)容物，體積：見小瓶標(biāo)簽

1 瓶

1 瓶

1 瓶

2 個(gè)平板

1 瓶

需要但未提供的其他材料和設(shè)備：

· 20、30、50 和 100µl 移液器

· 回旋振蕩器

· 多通道移液器或微孔板清洗裝置

· 微孔板光度計(jì) (450 nm)

· 蒸餾水

5. 標(biāo)本采集和儲(chǔ)存

可使用 EDTA 或肝素血漿、尿液和細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。

應(yīng)避免樣本反復(fù)凍融。

血漿

可使用 EDTA 或肝素血漿。不應(yīng)使用溶血和脂血樣本。

樣品可在 2-8 °C 下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá) 6 小時(shí)。對(duì)于更長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存（長(zhǎng)達(dá) 6 個(gè)月），樣品必須在-20 °C 下冷凍。

尿液

本試驗(yàn)以及收集的尿液均可采用自發(fā)性尿液。在這種情況下，應(yīng)收集 24 小時(shí)內(nèi)排泄的尿液總量，并在含有 10-15 mL 6M 鹽酸（作為防腐劑）的單個(gè)瓶中混合。避免暴露于陽(yáng)光直射。測(cè)定總體積并取等份試樣進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于疑似腎臟疾病的患者，也應(yīng)檢測(cè)肌酐濃度。尿樣可在-20 ℃ 保存至少 6 個(gè)月。

尿樣必須用蒸餾水以 1:15 稀釋。測(cè)定前用水。

細(xì)胞培養(yǎng)基

試驗(yàn)中可使用 DMEM 和 RPMI 等培養(yǎng)基。用戶必須檢查其他媒體。

6. 試劑和樣品制備

6.1. 試劑制備

清洗緩沖液

用蒸餾水稀釋內(nèi)容物。水的總體積為 1,000 mL。

稀釋的清洗緩沖液必須在 2-8 ℃ 下儲(chǔ)存長(zhǎng) 4 周。在-20 ℃ 下冷凍儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間。

平衡試劑

用蒸餾水溶解內(nèi)容物。水（體積參見小瓶標(biāo)簽），短暫混合，置于滾筒混合器上至少 20 min。小心處理，以盡量減少泡沫形成。復(fù)溶后的平衡試劑應(yīng)在-20 ℃ 下冷凍儲(chǔ)存，并在小瓶標(biāo)簽上打印的失效日期前保持穩(wěn)定。

?；噭?/span>

將一瓶?jī)?nèi)容物溶于 1.5 mL

并振搖 5 次

在定軌振蕩器上運(yùn)行分鐘。?；噭┍仨氃谂R用前制備。使用后，必須丟棄試劑。

第 2 個(gè)和第 3 個(gè)小瓶分別允許進(jìn)行第 2 次和第 3 次運(yùn)行檢測(cè)。如果要在一次運(yùn)行中使用整個(gè)試劑盒，建議合并三瓶酰化試劑的溶解內(nèi)容物。

請(qǐng)注意，溶劑與許多塑料材料（包括塑料托盤）發(fā)生反應(yīng)；溶劑不與正常移液器吸頭和玻璃裝置發(fā)生反應(yīng)

溶劑易揮發(fā)，溶解的?；噭┭杆僬舭l(fā)。因此，請(qǐng)做不一起使用具有大表面的托盤  用多通道移液器移取?；噭Ｏ喾?，使用 Eppendorf multipette（或類似器械），用溶解的?；噭┲苯訌男∑抗嘌b注射器并逐孔加入。

所有其他試劑均為即用型。

6.2. 樣品制備（酰化）

使試劑和樣本達(dá)到室溫。建議重復(fù)測(cè)定。

酰化反應(yīng)板的孔只能使用一次。因此，使用前請(qǐng)標(biāo)記各孔。

1. 各移取 50µl 標(biāo)準(zhǔn)品 1-6、50µl 對(duì)照品 1 和 2，

50µl EDTA 血漿樣本，20 µl肝素血漿，50µl 尿液樣本（用蒸餾水以 1:15 稀釋。水）和 50µl 細(xì)胞培養(yǎng)基樣品至反應(yīng)板的相應(yīng)孔中。

2. 移取各 50µl ?；彌_液至所有孔中。

3. 移取 50µl 蒸餾水。所有含有血漿樣本的孔中均有水。

• 分別移取 50µl 平衡試劑至含有標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、尿樣和細(xì)胞培養(yǎng)基的孔中  樣品。分別移取 30µl 平衡試劑至含有肝素血漿的孔中。請(qǐng)勿移取至含有 EDTA 血漿樣本的孔中?；旌戏磻?yīng)板 10 秒。
• 分別移取 10µl 酰化試劑至所有孔中并繼續(xù)  步驟 6。立即。顏色變?yōu)樽仙?/span>

請(qǐng)注意，溶劑與許多塑料材料（包括塑料托盤）發(fā)生反應(yīng)；溶劑不與正常移液器吸頭和玻璃裝置發(fā)生反應(yīng)

溶劑易揮發(fā)，溶解的?；噭┭杆僬舭l(fā)。因此，請(qǐng)做不使用具有大表面的托盤和多通道移液器移取酰化試劑。相反，使用 Eppendorf multipette（或類似器械），用溶解的?；噭┲苯訌男∑抗嘌b注射器，并逐孔灌裝。

• 室溫下在定軌振蕩器上以中頻孵育 15 min。做不蓋住孔或板；在振蕩器上保持板打開。

7. 移取 50µl 抗血清至所有孔中。

• 室溫下在定軌振蕩器上以中頻孵育 30 min。做不蓋住孔或板；在振蕩器上保持板打開。

每取 50µl 用于 ELISA。

7. 檢測(cè)方法 (ELISA)

使試劑和樣本達(dá)到室溫。建議重復(fù)測(cè)定。

1. 分別移取 50µl 制備的標(biāo)準(zhǔn)品 1 至 6、對(duì)照品和樣品，置于包被微量滴定條的相應(yīng)孔中。

2. 室溫 (20-25 ℃) 下在定軌振蕩器上以中頻孵育 60 min。

備選方案：手動(dòng)短暫振搖微孔板，孵育 90 min，不得振搖。

• 棄去或吸出孔內(nèi)容物，分別加入 300µl 清洗緩沖液，再次棄去或吸出孔內(nèi)容物。通過輕敲干凈吸水紙上的倒置板去除殘留液體。

重復(fù)洗滌程序 4 次。

4. 分別移取 100µl 酶結(jié)合物至所有孔中。

5. 室溫下在定軌振蕩器上以中頻孵育 20 min。

備選方案：手動(dòng)短暫振搖微孔板，孵育 25 min，不振搖

6. 清洗：重復(fù)步驟 3。

7. 吸取各 100µl 底物至所有孔中。

8. 室溫 (20-25 °C) 下在定軌振蕩器上以中頻孵育 20±5 min。

備選方案：手動(dòng)短暫振搖微孔板，孵育 20±5 min，不振搖

9. 移取各 100µl 終止液至所有孔中。

• 在 15 min 內(nèi)，在微孔板光度計(jì)中讀取 450 nm（參考波長(zhǎng)在 570-650 nm 之間）處的光密度。

8. 結(jié)果計(jì)算

在半對(duì)數(shù)曲線圖上，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度

（x 軸，對(duì)數(shù)）對(duì)其相應(yīng)的光密度（y 軸，線性）作圖?；蛘撸鳂?biāo)準(zhǔn)品和樣品的光密度可與零標(biāo)準(zhǔn)品的光密度相關(guān)，以 OD/OD 比值表示大值然后繪制在 y 軸上。建議采用 4 參數(shù)迭代或三次樣條進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)照品、血漿樣品和細(xì)胞培養(yǎng)基的濃度可以使用其平均光密度直接從該標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取。

肝素血漿樣本的讀取濃度必須乘以因子 2.5。

尿液樣本的讀取濃度必須乘以因子 15。

轉(zhuǎn)換：1 ng/mL 相當(dāng)于 9.0 nmol/L

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：

9. 試驗(yàn)特征

9.1 正常值范圍

以下給出的參考范圍應(yīng)僅作為指導(dǎo)原則。建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的正常值。

9.2 靈敏度

取零參比品吸光度的 2 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取相應(yīng)值，確定檢測(cè)下限。

9.3. 特異性（交叉反應(yīng)性）

檢測(cè)結(jié)構(gòu)相關(guān)組分對(duì) ELISA 方法中使用的抗組胺抗血清的可能干擾。

9.4. 恢復(fù)

向各樣品中加入遞增量的組胺。分析各加標(biāo)樣品。采用理論預(yù)期值和實(shí)際測(cè)定值，估算不同濃度下組胺的分析回收率。

濃度 (ng/ml)

9.5. 線性

使用樣品的不同稀釋液研究 ELISA 方法的線性。

濃度 (ng/ml)

9.6. 重現(xiàn)性

通過測(cè)定批內(nèi)和批間變異系數(shù) (cv)，研究 ELISA 方法的重現(xiàn)性。

濃度 (ng/ml)

10. 文獻(xiàn)

• Nettis,E.;Colanardi,A.;Ferrannini,A. (2005) :

抗組胺藥作為調(diào)節(jié)炎癥的重要工具

曲線中位數(shù)化學(xué)-抗炎藥和抗過敏藥, 4, 81-89

• 松本，J<unk>Matsuda,H.（2002 年）：

吡喹酮治療日本血吸蟲感染后肥大細(xì)胞依賴性組胺釋放：對(duì)化療相關(guān)不良反應(yīng)的影響寄生蟲研究 88:888–893

• Belic,A.;Grabnar,I.;Karba,R.;et al.(1999)：

組胺和甲基組胺動(dòng)力學(xué)的相互依賴性：建模和模擬方法

生物學(xué)和醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī) 29，361-375

• Martens-Lobenhoffer,J.;Neumann,H. (1999) :

人尿中 1-甲基組胺和 1-甲基咪唑乙酸測(cè)定作為肥大細(xì)胞增多癥診斷工具

色譜學(xué)報(bào) B，721，135-140

• Prell,G.;Green,J.;Elkashef,A. (1996) :

精神分裂癥患者尿液排泄與腦脊液中生物胺及其代謝產(chǎn)物的關(guān)系

精神分裂癥研究 19，171-176

• Eberlein-König,B.;Ullmann,S.;Thomas,P.;et al.(1995)：

蜂毒過敏患者在脫敏治療成功或失敗后因刺痛激發(fā)導(dǎo)致的類胰蛋白酶和組胺釋放

臨床和實(shí)驗(yàn)過敏，第 25 卷，第 704-712 頁(yè)

• Koller,D.;Rosenkranz,A.;Pirker,C.;.等人(1992)：

青霉素致敏患者全血嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺的研究

過敏：47:459-462。

• Marquardt,D.;Wasserman,S. (1982) :

肥大細(xì)胞在過敏性疾病和肥大細(xì)胞增多癥中的作用

West JMed;137:195-212

• Butchers,P.;Vardey,C.;Skidmore,I.;et al.(1980)：

獼猴支氣管灌洗的含組胺細(xì)胞。過敏性組胺釋放的時(shí)間進(jìn)程和抑制

Archs Allergy appl.免疫。62:205-212

移液方案樣品制備

振搖 10 秒

立即室溫下振搖 15 min，保持平板打開

室溫下振搖 30 min，留板，每取 50µl 用于 ELISA

ELISA 移液方案

室溫下振搖 60 min4 次清洗

室溫下振搖 20 min4 次清洗

室溫下振搖 15-25 min

450 nm 處吸光度讀數(shù)