一、技術(shù)方案

•小鼠血小板表面糖蛋白的流式細(xì)胞術(shù)分析

•免疫組織化學(xué)（采用丙酮固定的冰凍切片）

•免疫沉淀

•免疫印跡（蛋白質(zhì)印跡分析）

二、小鼠血小板表面糖蛋白的流式細(xì)胞術(shù)分析

（1）緩沖液和試劑

•Tris 緩沖鹽水 / 肝素（TBS/Hep）：20 mM Tris/HCl；137 mM NaCl；pH 7.3；含 20 U/ml 肝素。

•磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：137 mM NaCl；2.7 mM KCl；1.5 mM KH?PO?；8 mM Na?HPO?；pH 7.14。

•Tyrode's 緩沖液（改良型）：134 mM NaCl；0.34 mM Na?HPO?；2.9 mM KCl；12 mM NaHCO?；20 mM Hepes；pH 7.0；5 mM 葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。

•腺苷三磷酸雙磷酸酶（Apyrase）：10 U/ml 儲(chǔ)備液（溶于雙蒸水，-20℃保存）。

•前列環(huán)素（前列腺素 I?，PGI?）：1 mM 儲(chǔ)備液（溶于雙蒸水，-20℃保存）。

•CaCl?：1 M 儲(chǔ)備液（溶于雙蒸水）。

（2）稀釋或洗滌全血的制備

1.用肝素化玻璃毛細(xì)管（如 ringcap）從眼眶后叢采集 50ul 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 試管中。

2.用 1 ml Tyrode's 緩沖液稀釋，用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

3.若要制備 “洗滌過(guò)的血液"：將稀釋血液以 900×g離心 5 分鐘，棄上清，將沉淀重懸于 1.25 ml Tyrode's 緩沖液中。

4.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，直接加入 1 mM CaCl?。

注意：對(duì)于凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化，需去除血漿以避免抗凝血酶活性的干擾。

（3）洗滌小鼠血小板的制備

“洗滌血小板" 的制備耗時(shí)更長(zhǎng)，但需要更多血液，且所得血小板制品可使用數(shù)小時(shí)。

1.用 1.5 cm 玻璃毛細(xì)管從眼眶后叢采集 0.5–1 ml 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 試管中。

2.樣本以 500×g離心 5 分鐘，將 ** 富含血小板的血漿（PRP）** 轉(zhuǎn)移至新試管（為回收血小板，需取包含所有紅細(xì)胞的完整白色層）。

3.將血小板懸液以 300×g離心 8 分鐘，將無(wú)紅細(xì)胞的 PRP 轉(zhuǎn)移至新試管。

4.加入 0.5uM 前列環(huán)素（PGI?），以 1300×g離心 5 分鐘。

5.將血小板沉淀重懸于 1 ml Tyrode's 緩沖液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸雙磷酸酶和 0.5uM 前列環(huán)素，37℃孵育 5 分鐘后，以 1300×g離心。

6.重復(fù)步驟 5：將血小板沉淀重懸于 0.5 ml Tyrode's 緩沖液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸雙磷酸酶，37℃孵育 30 分鐘。

（4）血小板表面糖蛋白的單色分析

1.將 5ul特異性抗體或陰性對(duì)照抗體與 25ul “稀釋全血" 或 “洗滌過(guò)的血液" 加入測(cè)定管，渦旋振蕩 1–2 秒。

2.室溫孵育 15 分鐘。

3.加入 400ul PBS 終止反應(yīng)，并在 30 分鐘內(nèi)完成分析。

（圖示說(shuō)明：樣本按上述方法與 FITC 偶聯(lián)的對(duì)照 IgG（黑線）、抗 - GPVI 或抗 - GPV 孵育。通過(guò) “ 前向散射（FSC）/ 側(cè)向散射（SSC）特征對(duì)血小板設(shè)門(mén)；設(shè)門(mén)（R1）血小板的熒光 1（FL1）"強(qiáng)度在單獨(dú)直方圖中顯示。RBC：紅細(xì)胞。）

（5）血小板活化的雙色分析

1.向測(cè)定管中加入 5ul特異性抗體或陰性對(duì)照抗體，同時(shí)加入 5ul泛血小板標(biāo)志物。

2.此時(shí)可加入小體積（<5ul）額外試劑（如抑制劑）。

3.加入 25ul “稀釋全血"“洗滌過(guò)的血液" 或 “洗滌過(guò)的血小板（1×10?個(gè)）"，渦旋振蕩 1–2 秒。

4.室溫孵育 15 分鐘；加入 400ul PBS 終止反應(yīng)，并在 30 分鐘內(nèi)完成分析。

（圖示說(shuō)明：洗滌后的小鼠血小板與 PBS（靜息組）或凝血酶（0.1 U/ml），以及 FITC 和 PE 偶聯(lián)的單克隆抗體（mAbs）共同孵育。通過(guò)GPIX 或 GPIIbIIIa 的表達(dá)對(duì)血小板設(shè)門(mén)（FL1；gate 1）。）

三、免疫組織化學(xué)（采用丙酮固定的冰凍切片）

請(qǐng)注意：不建議對(duì)（多）聚甲醛固定的樣本進(jìn)行免疫染色 —— 因?yàn)榇蠖鄶?shù)大鼠抗體在小鼠組織上的染色效果較差。

1.將冰凍組織切片貼于載玻片，4℃下用冰冷的 100% 丙酮固定 20 分鐘；室溫下干燥樣本過(guò)夜。

2.為減少試劑用量，可用防水筆在載玻片的組織切片周圍畫(huà) “疏水環(huán)"；后續(xù)所有步驟中，該環(huán)內(nèi)區(qū)域不得干燥，因此建議在濕盒中進(jìn)行孵育。

3.切片在 PBS 中孵育 20 分鐘。

4.若使用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗：將切片與 0.03% H?O?在室溫下孵育 10 分鐘（抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性），再用 PBS 沖洗切片 3 次（每次 5 分鐘）。

5.切片在封閉液（二抗宿主物種的血清，用 PBS 按 1:10 或 1:100 稀釋）中室溫孵育 1 小時(shí)。

6.用封閉液稀釋的一抗（2–10ug/ml）覆蓋切片，室溫孵育 2 小時(shí)。

7.用 PBS 沖洗切片 3 次（每次 5 分鐘）。

8.用熒光團(tuán)偶聯(lián)或過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（如親和純化的驢抗大鼠 IgG-FITC 或 - HRP，按制造商說(shuō)明用封閉液稀釋）覆蓋切片，室溫孵育 1 小時(shí)。

9.吸去多余液體，用 PBS 沖洗 3 次（每次 5 分鐘）。

10.a）熒光染色的樣本可直接用熒光顯微鏡分析。

11.b）若要顯示 “過(guò)氧化物酶標(biāo)記的結(jié)構(gòu)"：用新鮮制備的3 - 氨基 - 9 - 乙基咔唑（AEC）底物覆蓋切片，孵育至顯微鏡下可見(jiàn)紅色染色（時(shí)間 5–30 分鐘不等）；在出現(xiàn)橙色背景染色前，用去離子水沖洗終止反應(yīng)。如需復(fù)染，將樣本與蘇木精孵育 30–240 秒，再用流動(dòng)溫水沖洗切片 20 分鐘；最后用水性包埋液封片。

四、免疫沉淀

（1）緩沖液和試劑

•PBS/EDTA：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH?PO?，8.0 mM Na?HPO??2H?O，pH 7.3；含 5 mM EDTA。

•IP 緩沖液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，2 mM PMSF，10ug/ml 亮抑酶肽，10ug/ml 抑肽酶，1ug/ml 胃蛋白酶抑制劑。

•Igepal：10% 儲(chǔ)備液（溶于雙蒸水）。

•2×SDS - 樣本緩沖液：10%β- 巰基乙醇（用于還原緩沖液），10% Tris 緩沖液（1.25 M），20% 甘油，4% SDS，0.02% 溴酚藍(lán)。

（2）操作步驟

1.洗滌小鼠血小板或細(xì)胞（每次免疫沉淀用 1×10?個(gè)）3 次：每次用 1 ml PBS/EDTA，5 分鐘，1300×g；然后重懸于 IP 緩沖液。

2.加入 1% Igepal，室溫裂解血小板 15–20 分鐘。

3.以 10,000×g離心 5 分鐘去除細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新管。

4.加入 20ul“ 洗滌過(guò)的蛋白 G 瓊脂糖（PGA）" 進(jìn)行 “預(yù)清除"，4℃孵育至少 3 小時(shí)。

5.樣本以 3,000×g離心 5 分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入 “數(shù)據(jù)表指定濃度的抗體"（通常 2–5ug/ml），30 分鐘后加入 25ul 洗滌過(guò)的 PGA；4℃下旋轉(zhuǎn)孵育至少 2 小時(shí)（最好過(guò)夜）。

6.洗滌沉淀物：樣本以 3,000×g離心 1 分鐘；向 PGA 沉淀中加入 1 ml 含 1% Igepal 的 1×IP 緩沖液，再以 3,000×g離心 1 分鐘。

7.用 plain IP 緩沖液洗滌 PGA 沉淀 2 次（每次 1 分鐘，3,000×g）。

8.將沉淀重懸于 25ul 1×SDS 樣本緩沖液（還原或非還原型），煮沸 5 分鐘；樣本可冷凍（-20℃）備用，或用于 SDS-PAGE 及后續(xù)免疫印跡分析。

五、免疫印跡（蛋白質(zhì)印跡分析）

（1）緩沖液和試劑

•裂解緩沖液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，0.05% NaN?，1% Igepal。

•PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH?PO?，8.0 mM Na?HPO?·2H?O，pH 7.3。

•PBS-5% 牛奶：含 5% 非脂干奶的 PBS。

•PBST：含 0.1% Tween 20 的 PBS。

•PBST-1% 牛奶：含 1% 非脂干奶的 PBST。

（2）操作步驟（所有步驟可在室溫下進(jìn)行）

1.用裂解緩沖液制備小鼠血小板或細(xì)胞的裂解物，與（2×）SDS 樣本緩沖液在 95℃孵育 5 分鐘。

2.通過(guò) "SDS - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）"分離蛋白質(zhì)（還原或非還原條件，依數(shù)據(jù)表說(shuō)明），然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。

3.用 PBS-5% 牛奶封閉膜，振蕩孵育1 小時(shí)。

4.用含 2–5ug/ml 一抗的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振蕩 1 小時(shí)。

5.用 PBST 沖洗膜 2 次，再用 PBST 洗滌 2 次（每次 30 分鐘）；洗滌程序可簡(jiǎn)化為 “每次 10 分鐘，共 3 次"，但需單獨(dú)驗(yàn)證。

6.用含 HRP 偶聯(lián)抗大鼠 IgG 的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振蕩 45–60 分鐘。

7.用 PBST 沖洗膜 2 次，再用 PBST 洗滌 2 次（每次 30 分鐘）。

8.用 "ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）"顯示結(jié)合的抗體。

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（注：本文內(nèi)容基于品牌公開(kāi)資料及行業(yè)常規(guī)信息整理，具體以品牌信息文檔為準(zhǔn)。）